ПОЛУЧЕНИЕ  МАГНИТНЫХ  МИКРОСФЕР

ДЛЯ  ИММУНОМАГНИТНОЙ  СЕПАРАЦИИ  КЛЕТОК

 

А. А. Романенко, Ю. Ю. Лысенко, В. И. Бандурко, Г. Я. Хулуп.

Белорусская медицинская академия последипломного образования,

Центральная научно-исследовательская лаборатория,

Республика Белоруссия, Минский район, посёлок Лесной,

дом 35, телефон: 202 – 46 – 43, E – mail: Narielle@mail.ru

 

Магнитная сепарация широко используется в биологии, биотехнологии лекарств, в научно-практической работе врачей-клиницистов и исследователей в различных областях медицины. Микросферы используют для диагностики иммунодефицитных состояний, изоляции клеток и костного мозга по поверхностным маркерам, для выделения ДНК, бактерий, антигенов. Возможность проведения иммунных реакций с использованием иммуноактивных веществ (антител, антигенов), иммобилизованных на магниточувствительных микроносителях, позволяет не только осуществить выделение требуемых субпопуляций клеток без использования сложного и дорогостоящего оборудования, но и позволяет разработать экспресс-методы диагностики ряда заболеваний, предусматривающие возможности протекания иммунных реакций [1, 2].

Выделение стволовых клеток из костного мозга и крови при помощи композиционных магниточувствительных материалов - одна из важных задач современной медицины, так как решение этой проблемы может иметь приложение в современной онкологии и гематологии при трансплантации стволовых клеток. В лечебных целях иммуномагнитная сепарация клеток начала широко использоваться в клиниках для выделения CD34+ -  позитивных клеток с целью последующего воспроизведения костного мозга у больных различными видами лейкозов, раком молочной железы с метастазами, раком желудка, распространённым или ограниченным мелкоклеточным раком лёгких, круглоклеточной или недифференцированной саркомой, метастатической нейробластомой, при апплазиях костного мозга и в случае тотального облучения [3,4]. Источником стволовых клеток является периферическая кровь. Выделение их из крови имеет ряд преимуществ: процесс выделения менее инвазивен, не требует анестезии и стволовые клетки можно пересаживать при лейкозе абсолютно не леченному рецепинту с высокой вероятностью восстановления гемопоэза. Использование для трансплантации стволовых клеток, полученных из периферической крови, приводит к более быстрой приживляемости и сокращению сроков госпитализации по сравнению с автотрансплантацией костного мозга.

Однако одной из первостепенных задач данного научного направления является разработка эффективного релизинг-агента для разделения комплекса "микросфера - стволовая клетка", так как, имея размеры 1 - 4 мкм в диаметре, магнитные микросферы в комплексе со стволовыми клетками могут образовывать тромбы при внутривенном введении.

Микросферы представляют собой дисперсный магнитный материал шарообразной формы, защищённый тонкой плёнкой, которая упаковывает магнитный материал и обеспечивает определённую поверхностную зону для абсорбции или связывания молекул. Однородность размера сфер и формы обеспечивает постоянные физические и химические свойства, что приводит к высококачественным воспроизводимым результатам. Оболочкой частиц служит либо природный биодеградируемый материал (целлюлоза, агароза, альбумин, желатин, декстран), либо синтетический (полистирол, сополимеры стирола или дивинилбензола, полиакролеина, полиакриламида, поливинилового спирта, винилпиридина).

Синтетические полимеры обладают рядом преимуществ: в частности, наличием в структуре молекулы полимера различных функциональных групп ( – OH, – COH, – COOH,    – NH₂, – SO₃H), которые способствуют образованию химических и физических связей с биосубстратами. Кроме того, на поверхность полимерной матрицы можно наносить лиганды (стрептовидин, олигопротеин A и G, моноклональные или поликлональные антитела).

Синтез микросфер осуществляли методом эмульсионной полимеризации [5,6]. Важное значение в эмульсионной полимеризации имеет процесс получения устойчивых эмульсий. На устойчивость эмульсий влияет, главным образом, концентрация мономера и эмульгатора. На стадии получения микроэмульсий в систему вводится магнитный материал. В качестве магнитного материала использовали получивший широкое распространение, благодаря простоте его получения, смешанный оксид железа (II) и (III) - магнетит.

Магнетит получали по методике быстрого смешения насыщенных растворов солей железа (II) и (III) (сульфата железа и хлорида железа, соответственно) с концентрированным раствором аммиака (25 массовых %) при комнатной температуре. Полученный высокодисперсный магнетит многократно промывали дистиллированной водой до нейтрального значения маточного раствора (рН = 7,0) с поэтапной магнитной декантацией осадка. После промывки полученную взвесь магнетита в воде подвергали воздействию ультразвукового поля ("озвучиванию") в течение 2 - 3 минут. Фазовый состав полученного магнетита определяли с помощью рентгенофазового анализа. Согласно результатам анализа магнитный материал представлял собой смесь магнетита и маггемита. Рефлексы были выражены не чётко, что позволило предположить малый (субмикронный) размер полученных частиц.

Водную суспензию магнитных частиц вводили в реакционную смесь эмульсионной полимеризации, содержащую мономер и эмульгатор, где вода выступала в качестве дисперсионной среды. Полученную реакционную смесь перемешивали в течение 30 минут при скорости вращения мешалки ~ 1500 оборотов в минуту. После этого добавляли инициатор радикальной полимеризации (персульфат калия, азо-бис-изобутиронитрил, перекись дикумила, перекись водорода). Реакцию проводили при температуре 70°С в течение 24 часов при скорости вращения мешалки ~ 1500 оборотов в минуту.

При мягком окислении магнетита может образовываться маггемит (g - Fe₂O₃), обладающий магнитными свойствами [7]. В процессе радикальной полимеризации магнетит подвергается окислению, в результате чего переходит в маггемит. Это хорошо видно по изменению окраски реакционной смеси: от тёмно-серой, сразу после добавления магнетита, до коричневой, спустя 3 – 4 часа после введения инициатора радикальной полимеризации. На основании проведённых исследований был предложен следующий механизм окисления магнетита на примере пероксисоединений:

 

K₂S₂O₈ « 2K ⁺ + S₂O₈ ^{2 –}

 

S₂O₈ ^{2 –}  + H₂O ® 2H ⁺ + 2SO₄ ^{2 –}  + O^.   (1/2 O₂)

 

2 Fe₃O₄ + O^. ® 3 Fe₂O₃

 

общее уравнение реакции:

 

K₂S₂O₈ + 2 Fe₃O₄ + H₂O ® 2KHSO₄ + 3 Fe₂O₃

 

Продукт полимеризации представлял собой коллоидный раствор коричневого цвета устойчивый продолжительное время. Дисперсная фаза состояла из полимерных шариков, включающих в свой объём магнитный материал. Микросферы хорошо осаждались на постоянном магните, что было очень удобно для их использования в медико-билогических целях. Однако при полном высушивании некоторая часть магнитных микросфер слипалась, образуя устойчивые агрегаты, которые не разрушались при добавлении воды и встряхивании.

Полученные дисперсии микросфер использовали для иммуномагнитной сепарации клеток с целью их фенотипирования, трансплантации и исследования механизмов клеточного и гуморального иммунитета.

 

Библиографический  список:

 

1.      Horak D. Priprava magnetickych hydrogelovych microcastic disperzni polymerizaci 2 - hydroxyethyl-methakrylatu. // Konference " Magnetike separace v biovedach a iotechnolologiich" Sbornik 2. Ceske Budejovice, 14.9 - 15.9.1999., str.18 - 21.

2.      Vardtal F., Kvakheim G., Lea T. E. etc. Depletion of T-lymphocytees from human bon marrow. Use of magnetic monosized polymers microspheres coated with T-lymphocyte-specific monoclonal antibodies // Transplantation - 1987 - Vol. 43 - № 3 - P.366 - 371.

3.      Krause D. S., Fackler M. J., Civin C. I., May W. S. CD34: Structure, biology and clinical utility // Journal of American Society of hematology - 1996 - Vol. 87 - № 1 - P.1 - 13.

4.      To L. B., Haylock D. N., Simmons P. J. The biology and clinical uses of blood stem cells. // Journal of American Society of hematology - 1997 - Vol. 89 - № 7 - P.2233 - 2258.

5.      Ugelstad J., Berge A., et al. Praparation and application of new monosized polymer particles. // Prog. Polym. Sci. - 1992 - № 17 - P.87 - 161.

6.      Tseng C. M., Lu Y. Y. et al. Uniform polymer particles by dispersion polymerization in alcohol. // Journal of Polymer Science: Polym. Chem. Ed. - 1986 - Vol. 24 - P.2995 - 3007.

7.      Jolivet J.- P., Tronc E., Barbe C., Livage J. Interfacial electron transfer in colloidal spinel iron oxide silver ion rediction in aqueous medium. // Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 1990 - Vol.138. - № 2. - P.465 - 472.