ПРИМЕНЕНИЕ  МАГНИТНЫХ  НАНОЧАСТИЦ

В  ДИАГНОСТИКЕ  И  ЛЕЧЕНИИ  ТУБЕРКУЛЁЗА

 

Владимирский М. А. ¹, Шипина , Л.К. ¹,

Филиппов В. И. ², Иртуганова О. А. ³, Стаханов В. А. ⁴

 

1.       НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М. Сеченова.

2.       Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН.

3.       Московский НПЦ борьбы с туберкулезом.

4.       Московский государственный медицинский университет.

 

1. Иммуномагнитная технология пробоподготовки диагностических образцов для   вы­явления микобактерий туберкулёза методами люминесцентной микроскопии и полимеразной цепной реакции

 

Современная диагностика и дифференциальная диагностика туберкулеза в существен­ной степени зависит от эффективности обнаружения микобактерий туберкулеза (МБТ) в диагностических материалах: в мокроте, как наиболее массовом объекте исследования, моче и других биологических жидкостях, а также биопсийных материалах.

Основные традиционные микробиологические методы исследования: микроскопия мазков и культуральное исследование осадков гомогенизированных и центрифугирован­ных образцов мокроты, к сожалению, в отечественных специализированных микробиоло­гических лабораториях весьма малоэффективны. Если в США и Западной Европе МБТ выявляют в около 80% случаев активного туберкулеза легких, то в России в последние годы, в связи с использованием традиционно устаревших технологий и проблемами фи­нансирования, лишь в около 40 %; в СССР – в немного более 50% случаев. Проблемы эф­фективности исследований связаны с требованием достаточной чувствительности анализа и временем, необходимым для получения результатов анализа. Если микроскопия мазков позволяет выявить 20-30% больных туберкулезом и получить результат обычно на сле­дующий день, то культуральное исследование (посев) микобактерий на классических се­лективных твердых питательных средах занимает обычно 6-12 недель.

Современные более быстрые системы культивирования типа Bactec, в которых исполь­зуются жидкие питательные среды с радиометрической или флуоресцентной детекцией результатов позволяют определить рост МБТ в течение, в среднем, 2-х недель, однако, от­рицательный результат может быть получен лишь через 38-42 дня, поскольку к этому времени выявляется рост около 10 % культур МБТ. К тому же после регистрации положи­тельного результата роста требуется еще 7-10 дней для идентификации принадлежности культивированного материала к микобактериям туберкулезного комплекса.

Определение МБТ при внелегочных формах туберкулеза (туберкулез мочеполовой сис­темы, лимфоузлов, костей и суставов) является еще более трудной проблемой в связи с очень низкой (5-20%) эффективностью исследований. При этом именно внелегочные формы туберкулеза наиболее трудны для диагностики при использовании рентгенологи­ческих методов исследования, поскольку они чаще всего не указывают на специфический характер изменений. И даже морфологическое исследование пункционных биопсийных материалов не всегда может установить этиологическую природу заболевания.

       Молекулярно-генетический анализ, в частности, полимеразная цепная реакция (ПЦР) стала наиболее крупным достижением в лабораторных технологиях последнего де­сятилетия, в том числе в диагностике туберкулеза. Число публикаций, посвященных при­менению ПЦР в диагностике туберкулеза приближается к тысяче. Обзоры этого направ­ления приведены, например, в следующих публикациях 2001г.: Kaul K.M. «Molecular de­tection of M.Tuberculosis: impact of patient care» Clin. Chemistry 2001,47(8), 1553-1558 ; Soini H.,Musser J.M. «Molecular diagnosis of mycobacteria» Clin. Chemistry 2001,47(5), 809-814. Наиболее известные сертифицированные тест-системы крупных международных фирм – Roche «Amplicor МTB», полуавтоматизированной «Cobas Amplicor» и Gene Probe AMTD хорошо изучены. Они позволяют обнаружить возбудитель туберкулеза в мокроте в течение 1-2 дней с чувствительностью на уровне наиболее качественного культурального микробиологического анализа, т.е. в 75-80% случаев активного туберкулеза легких. Од­нако, стоимость указанных тест-систем (20 долларов за 1 анализ) весьма велика, особенно, для российских потребителей, являющихся бюджетными организациями.

В нашей стране, начиная с 1992 г. также проведено немалое количество научных ис­следований. Приказом Минздрава РФ № 64 от 21.02.2000 г. ПЦР утверждена в номенкла­туре клинических лабораторных исследований, в том числе и для выявления микобакте­рий туберкулеза. В России были сертифицированы и отечественные наборы реагентов для определения МБТ, например, набор «Политуб» (НПФ «Литех»).

Однако, в диагностике туберкулеза ПЦР-анализ используется пока очень мало. Про­блемы, рассматриваемые обычно при решении вопроса о применения ПЦР-анализа связы­вают с мнением об «избыточной» чувствительности анализа, приводящей при распро­страненном инфицировании населения и возможной внутрилабораторной контаминации продуктами предшествующих реакций к получению ложноположительных результатов. Трудности применения связывают также с требованиями трех изолированных помещений, высокой стоимости, квалификации исполнителей и трудоемкостью анализа.

В современных тест-системах для предотвращения внутрилабораторной контаминации продуктами предшествующих реакций – ампликонами с получением замещают дезокси­тимидинтрифосфат дезоксиуридинтрифосфатом и используют фермент урацил-ДНК-гли­козилазу (УДГ) для предварительной обработки реакционной системы ПЦР, что позволяет разрушить возможные контаминирующие ампликоны, содержащие дезоксиуридин вместо дезокситимидина. Последующее прогревание при 94°С инактивирует фермент УДГ и не препятствует амплификации в ПЦР. Такая технология позволила уменьшить первона­чально очень жесткие требования к помещениям и технике работы и обеспечила доста­точно высокий (98-99 %) уровень специфичности анализа при исследовании диагностиче­ских материалов пульмонологических пациентов, ранее инфицированных, но не болею­щих туберкулезом.

Таким образом, быстрыми, в рамках 1-2 дней, методами выявления возбудителя тубер­кулеза в мокроте, как массовом диагностическом материале являются метод флуорес­центной (люминесцентной) микроскопии и ПЦР-анализ.

Применение иммуномагнитных микрочастиц имеет целью повысить эффективность этих лабораторных технологий, уменьшить трудоемкость и повысить безопасность прове­дения анализа.

Эффективность выявления микобактерий туберкулеза (МБТ) в мокроте при подготовке образцов для получения мазков с последующим проведением микроскопии существенно зависит от способа первичной обработки мокроты, обеспечивающей гомогенность (раз­жижение) материала при сохранении жизнеспособности микобактерий, поскольку мате­риал обычно используется как для микроскопических, так и для культуральных исследо­ваний, и эффективности последующего концентрирования микобактерий в осадке. Наибо­лее употребляемым способом гомогенизирования мокроты является кратковременная ин­кубация (15-20 мин) в щелочных растворах – 2-4 % NaOH c добавлением или без добавле­ния N-ацетил-L-цистеина. Затем гомогенизированную мокроту традиционно центрифуги­руют в оптимальном режиме при 2500-3000g, что обеспечивает максимальное концентри­рование микобактерий в осадке. Более длительная инкубация материала в щелочных рас­творах приводит к уменьшению жизнеспособности микобактериальных клеток и отсутст­вию их роста в питательных средах, т.е. к снижению эффективности обнаружения возбу­дителя. К такому же результату приводит и недостаточно скоростной режим центрифуги­рования, т.к. число микобактерий в осадке и,соответственно, в микроскопируемом мазке снижается. На практике оптимальные условия подготовки проб мокроты не соблюдаются из-за одновременного большого числа обрабатываемых материалов и из-за отсутствия в отечественных лабораториях довольно дорогих центрифуг, позволяющих обеспечить ука­занный режим. Кроме того, сама процедура центрифугирования увеличивает возможность инфицирования атмосферы лаборатории.

Для решения проблем нами был разработан препарат иммуномагнитных частиц «Ми­косорб», который состоит из ферромагнитных частиц размером 2-5 микрон, связанных хе­латным методом (патент РФ № 2140084, 1998 г. «Матрица иммуносорбента») с большим количеством белка антител к микобактериям – иммуноглобулина IgG (80-90 мг на 1г маг­нитного носителя), полученного из высокотитражных сывороток кроликов, многократно иммунизированных инактивированными микобактериями.

Общая схема применения технологии иммуномагнитной сепарации из образцов мок­роты для выявления микобактерий с помощью микроскопии и ПЦР-анализа представлена на рисунке 1.

При первичной обработке образцов мокроты стадию лизиса в щелочной среде завер­шали нейтрализацией материала добавлением примерно  равного объема 0,5 М раствора натрия фосфата однозамещенного, содержащего цветной индикатор PH раствора – фено­ловый красный. Переход окраски раствора фиксировал его нейтрализацию. Нейтрализо­ванные образцы мокроты инкубировали с суспензией иммуномагнитных частиц, после чего осадок исследуемого материала, предназначенный для люминесцентной микроско­пии получали при центрифугировании (в том числе низкоскоростном – 1000-1500 об/мин) или путем осаждения феррочастиц при 15 минутной инкубации с помощью магнита, по­мещаемого у дна пробирки. Для магнитного осаждения мы использовали простейшие штативы для пробирок объемом 50 мл, в которых собирались и обрабатывались образцы мокроты, с вмонтированными в дно постоянными магнитами (магнитные штативы). Про­стейшее устройство для удержания магнитного осадка при декантации материала также было использовано. Из магнитных осадков готовили мазки, которые фиксировали и окра­шивали аурамин-родамином стандартным методом и определяли с помощью флуорес­центного микроскопа (использовали отечественный микроскоп типа «Люмам») окрашен­ные, с желто-зеленой флуоресценцией палочки размером 2-5 микрон.

Для оценки эффективности предложенного метода обработки диагностического мате­риала были проведены клинико-лабораторные испытания, результаты которых отражены в ряде публикаций, а также контрольные испытания специально разработанного диагно­стического набора «Микосорб».  Применение иммуномагнитного сорбента при подго­товке осадков для мазков, анализируемых с помощью флуоресцентной микроскопии, по­зволило на 20% увеличить число позитивных результатов и значительно увеличить коли­чество микобактерий, выявляемых в позитивных мазках по сравнению с контрольным по­лучением осадка после низкоскоростного центрифугирования, а магнитное осаждение без применения центрифугирования не уступало эффективности выявления микобактерий с использованием центрифугирования при 2500g.

Разработана нормативно-техническая документация на этот набор; в настоящее время проходит его регистрация в учреждениях Минздрава РФ.

При проведении обработки мокроты для последующего определения в ней МБТ мето­дом полимеразной цепной реакции (ПЦР) помимо необходимости эффективного концен­трирования возбудителя в осадке, технология выделения ДНК для анализа в ПЦР является важнейшим фактором его эффективности.

Хорошо известные методы фенол-хлороформенной экстракции ДНК из лизированного осадка мокроты с последующим ее осаждением этанолом из водной фазы или гуанидино­вой обработки с экстракцией ДНК на микропористых частицах стекла являются доста­точно трудоемкими и не дают оптимальных результатов. Дело в том, что в полученных таким образом образцах ДНК во-первых часто содержатся ингибиторы ПЦР, а во-вторых количество неспецифической (немикобактериальной) ДНК многократно превышает воз­можное количество специфической ДНК. Оба этих фактора значительно снижают чувст­вительность специфической амплификации в ПЦР. Кроме того, присутствие в пробе большого количества неспецифической ДНК часто существенно затрудняет определение результатов ПЦР при проведении гельэлектрофореза из-за размазывания («шмера») ДНК на поверхности геля.

 

Схема выявления возбудителя туберкулеза в мокроте с использованием иммуномагнитного сорбента "МИКОСОРБ"

                                   

                                     

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                  

                                                             

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Для решения этих проблем при проведении ПЦР-анализа с целью обнаружения мико­бактерий туберкулеза в пробах мокроты мы применили ранее разрабатывавшийся нами метод концентрирования микобактерий из мокроты с помощью магнитных частиц, свя­занных с антителами к микобактериям, и использовавшийся для увеличения эффективно­сти их обнаружения в мазках при люминесцентной микроскопии. Такой метод позволяет провести селективную сепарацию микобактерий из материала мокроты и использовать их для проведения ПЦР минуя стадию экстракции ДНК.

При первичной обработке образцов мокроты стадия лизиса в щелочной среде заверша­лась нейтрализацией материала добавлением примерно  равного объема 1 M трис-гидро­хлорида, приготовленного добавлением 100 мл концентрированной соляной кислоты к 121 г трис-основания в 900 мл дистиллированной воды и содержащего в качестве цвет­ного индикатора феноловый красный 40 мг/л.

При нейтрализации образца окраска переходит от малинового к желтовато-красному. К гомогенизированному и нейтрализованному материалу мокроты вносили по 100 мкл сус­пензии иммуномагнитного сорбента и инкубировали при неинтенсивном перемешивании в течение 50-60 мин. Затем иммуномагнитные частицы собирали с помощью простого магнитного устройства (рис. 2), погружаемого на 10-15 мин внутрь пробирки с образцом. Магнитное устройство состоит из пластикового стержня с закрепленным на конце кону­сообразным постоянным магнитом («магнитная палочка»), которая помещается внутрь стандартного сменного пластикового наконечника (кончик закупорен погружением в рас­плавленный парафин) для пипеточного дозатора объемом 1-5 мл. Собранные, при визу­альном наблюдении, на боковых поверхностях пластикового наконечника магнитные час­тицы переносили в пробирки Эппендорф объемом 1,5 мл, в которые предварительно вно­сили по 0,7 мл нейтрального (PH 7,4) 0,02 М Tris-HCL буферного раствора. После извле­чения «магнитной палочки» собранные частицы освобождались легким вращением нако­нечника. Далее частицы центрифугировали 5-10 сек и супернатант отбрасывали.

ПЦР – анализ. К полученным осадкам иммуномагнитных частиц, содержащим связан­ные с ними микобактерии, вносили по 20-30 мкл 2% раствора тритона Х-100, микропро­бирки встряхивали и прогревали 30-40 мин при 95°С. Супернатант использовали в каче­стве ДНК-содержащего материала для проведения ПЦР с использованием праймеров Т4 и Т5 (по 15 пикомоль каждого) для амплифицирования специфического фрагмента инсер­ционного элемента IS 6110 (123 н.п.) ДНК микобактерий туберкулезного комплекса. В стандартную реакционную смесь, содержавшую замену одного из дНТФ (уридиндезок­ситрифосфат вместо тимидиндезокситрифосфата), добавляли по 1 ед. урацил-ДНК-глико­зилазы для инактивации возможной контаминации ампликонами. Подготовленную к ПЦР смесь инкубировали 10 мин при 37°С, а затем проводили реакцию по следующему прото­колу: 1 цикл: 94°С – 10 мин; 68°С – 2 мин; 72°С – 1 мин. Заключительный цикл: 72°С – 1 мин.

Результаты амплификации определяли с помощью стандартного агарозного гельэлек­трофореза с окрашиванием флуоресцирующих полос бромистым этидием.

 

Рисунок 2. Магнитное устройство для переноса иммуномагнитных частиц из исследуемого образца мокроты в микропробирку для проведения ПЦР-анализа. Слева направо: пластиковый наконечник, «магнитная палочка» и пробирка Эппендорф с перенесенными микрочастицами.

 

 

 

 

 

Результаты исследований образцов мокроты методом ПЦР-анализа.

 

При исследовании 118 образцов мокроты, полученных от пациентов с неспецифиче­скими (в основном, пневмония) заболеваниями легких не было выявлено ни одного поло­жительного результата ПЦР-анализа.

Результаты исследований образцов мокроты, полученных от 89 больных туберкулезом легких в начале лечения представлены на таблице 1.

 

Таблица 1. Сравнительные результаты выявления МБТ у больных

 туберкулезом легких при использовании пцр-анализа и культивирования

 

 

Представленные данные свидетельствуют о безусловно более высокой чувствительно­сти ПЦР-анализа, в среднем 75,3%, по сравнению с культуральным исследованием (42,7%) при обследовании всех клинических форм туберкулеза легких. При этом наи­большие различия выявляются при исследовании относительно небольших процессах – очаговых формах и инфильтративном туберкулезе без распада легочной ткани. При этих формах чувствительность ПЦР-анализа составила 63% против 25,9% при традиционном культивировании.

Представленные материалы демонстрируют, таким образом, большие возможности технологии иммуномагнитной сепарации микобактерий для повышения эффективности лабораторных методов диагностики туберкулеза.

 

2. Разработка и клигнические испытания тест-системы «Микосорб» для пробоподготовки образцов мокроты к люминесцентной микроскопии с целью выявления микобактерий.

 

Быстрое, с высокой чувствительностью выявление возбудителя туберкулеза в образцах мокроты полученных при обследовании лиц из групп повышенного риска заболевания ту­беркулезом или при подозрении на заболевание туберкулезом является одной из наиболее актуальных задач фтизиатрии. Флуоресцентная (люминесцентная) микроскопия мазков, приготовленных из осадков мокроты позволяет выявить кислотоупорные палочки в каче­стве предварительного, но достаточно быстрого и эффективного средства выявления воз­будителя туберкулеза.

Эффективность этого метода зависит от достаточного разжижения мокроты и качества осаждения микобактерий в осадках, из которых готовятся мазки. Разработанный Kubica в 1963 г. метод деконтаминации и разжижения мокроты является до настоящего времени общепризнанным как наиболее эффективный. Он состоит в использовании 4 % раствора гидроокиси натрия и 4 % раствора трехзамещенного лимоннокислого натрия (цитрат на­трия), смешиваемых в равных объемах с добавлением N-ацетил-L-цистеина из расчета 50-70 мг на образец мокроты. Растворы гидроокиси и цитрата натрия предварительно стери­лизуются, ацетил-цистеин добавляется ex tempore. Для эффективного осаждения микобак­терий в лизированных образцах мокроты, по материалам большого числа зарубежных ис­следований, рекомендуется центрифугирование при не менее 2,5-3 тыс. g, т.е. при 4-6 тыс. обор/мин, в зависимости от ротора.

Эти требования, к сожалению, обычно не выдерживается в практических лабораториях, в результате чего чувствительность исследования значительно уменьшается и результа­тивность флуоресцентного (люминесцентного) микроскопического метода выявления ми­кобактерий в российских лабораториях существенно уступает международным данным.

Для решения этих проблем нами была разработана тест-система «Микосорб», для про­боподготовки образцов мокроты к люминесцентной микроскопии с целью выявления ми­кобактерий. Эта тест-система включает в себя реагенты, необходимые для разжижения и деконтаминации мокроты, т.е. пробоподготовка может проводиться и для культурального исследования, реагенты для нейтрализации образцов, а также основной компонент тест-системы – иммуномагнитный сорбент «микосорб» для связывания микобактерий и их осаждения. Иммуномагнитный сорбент представляет собой ферромагнитные микрочас­тицы размером 3-5 микрон, содержащие 20-25 % оксида кремния, которые связаны с по­мощью хелатной связи с иммуноглобулином высокотитражной иммунной сыворотки кро­ликов, многократно иммунизированных убитыми микобактериями туберкулеза.

 

Приготовление растворов и обработка клинических образцов мокроты

Для проведения подготовки проб готовят следующие растворы реагентов из состава тест-системы:

1.                    Раствор 4 % гидроксида натрия готовят, растворяя в термостойкой посуде 20 г гидроксида натрия в 500 мл дистиллированной воды.

2.                    Раствор 0,1 М цитрата натрия готовят, растворяя 20 г трехзамещенного двухводного лимоннокислого натрия в 500 мл дистиллированной воды.

3.                    Раствор для нейтрализации образца – 78 г натрия фосфорнокислого одноза­мещенного (двухводный) растворяют в 1 л дистиллированной воды; к 1 л нейтрали­зующего раствора добавляют в качестве индикатора рН 40 мг фенолового красного, получая после растворения желтое окрашивание раствора.

Раствор для разжижения мокроты готовят ex tempore, смешивая равные объемы рас­твора натрия гидроксида и цитрата натрия, после чего добавляют сухой порошок N-аце­тил-L-цистеина из расчета 50-70 мг на 10 мл приготовленного раствора. Ацетилцистеин можно также добавлять непосредственно к мокроте из расчета 50-70 мг на 1 образец или больше при очень вязком образце.

 

Проведение подготовки проб мокроты

1.      К мокроте (5-10 мл) добавляют равный объем раствора для разжижения мокроты, пе­ремешивая исследуемый материал в течение в течение 30-60 секунд. Если мокрота плохо разжижена, добавить 20-40 мг порошка ацетилцистеина.

2.      Образцы мокроты нейтрализуют, добавляя равный объем нейтрализующего раствора фосфорнокислого натрия, содержащего индикатор. При нейтрализации мокроты окра­ска раствора переходит от малинового цвета к оранжевому.

3.      К нейтрализованной мокроте добавляют 0,1 мл суспензии иммуномагнитного сор­бента, перемешанного перед употреблением, и неинтенсивно перемешивают на шей­кере в течение 50-60 минут.

4.      После инкубации образцов с микрочастицами иммуномагнитного сорбента материал может быть центрифугирован при 1500-3000 обор/мин в течение 15 минут, либо маг­нитные микрочастицы осаждают с помощью постоянного магнита, используя для этого магнитный штатив в течение 20-30 минут. Магнитный штатив представляет со­бой штатив для пробирок объемом 50 мл, в дно которого вмонтированы блоки посто­янного магнита размером 40х40 мм из редкоземельных элементов (самарий-кобальт). Для получения осадка после магнитного осаждения супернатант удаляют, используя магнитное устройство для слива.

5.      Полученные после центрифугирования или магнитного осаждения осадки мокроты размешивают пипеткой с удлиненным наконечником; 0,1-0,2 мл взвеси наносят рав­номерно на предметное стекло готовят мазок, высушивая стекло в сушильном шкафу при 80°С в течение 1 часа. Окрашивание мазка аурамин-родамином и учет результатов проводят по стандартной методике (приказ МЗ СССР № 558, 1978 г.).

 

Проведение и результаты клинических испытаний тест-системы «Микосорб»

Клинические испытания проводились на базах Московского научно-практического центра борьбы с туберкулезом, Московской туберкулезной больницы №7 и городских противотуберкулезных диспансерах №4 и №15. Испытания проводились по 2-м схемам. В соответствии с 1-й схемой мокроту 66 пациентов собирали дважды в течение 2-х дней подряд. 1-й образец мокроты каждого пациента обрабатывали методом флотации с при­менением бензольного способа накопления микобактерий по стандартному методу в соот­ветствии с пособием, изложенным в приказе МЗ СССР 1978 г. 2-й образец мокроты обра­батывали с помощью реагентов набора «Микосорб», а именно, мокроту лизировали до­бавлением смеси равных объемов 4% растворов гидроксида натрия и цитрата натрия с до­бавлением N-ацетил-L-цистеина, нейтрализовали 0,5 М раствором однозамещенного фос­фата натрия, содержащим цветной индикатор нейтрализации феноловый красный и де­лили эти образцы на 2 равные части. 1 часть каждого такого образца центрифугировали при 3,0 тыс. обор/мин (около 2,5 тыс. g) с помощью отечественной центрифуги ЦАП 3-3,5 («Биофизаппаратура»), после чего из осадков готовили мазки, фиксировали, окрашивали аурамин-родамином стандартным методом и анализировали с использованием люминес­центного микроскопа «Люмам». К каждой 2-й части гомогенизированных и нейтрализо­ванных образцов добавляли иммуносорбент неинтенсивно смешивали 40-50 мин с помо­щью шейкера, после чего центрифугировали и проводили анализ аналогично описанному выше. Результаты этой части испытаний представлены на следующей таблице 1.

 

Таблица 1.

 

Диагноз	Число пациентов	Флотация	«Микосорб»
			Центрифуга	Центрифуга + иммуносорбент
Очаговый туберкулез л-х	9	0	0	0
Инфильтрат. туберкулез л-х	25	6	13	16
Диссеминир.+ фибр. каверн. туберкулез л-х	32	19	24	25
ВСЕГО	66	25	37	41

 

Приведенные данные демонстрируют относительно низкую эффективность метода флотации, более наглядную при анализе впервые заболевших пациентов. Например, среди 20 впервые заболевших пациентов с диагнозом инфильтративный туберкулез легких ме­тодом флотации микобактерии обнаружены лишь в 3-х случаях, тогда как при оптималь­ном разжижении и центрифугировании в 10 и 12 (иммуносрбент) случаях. В целом, ис­ходя из результатов этой части испытаний, очевидно, что эффективное разжижение и цен­трифугирование (при не менее 2,5 тыс. g) образцов мокроты может выявлять микобакте­рии в не менее 50% случаев активного туберкулеза, а применение иммуносорбента увели­чивает эффективность выявления дополнительно на 10%. В большинстве положительных результатов в мазках, полученных при обработке мокроты с использованием иммуномаг­нитного сорбента выявлялось большее число микобактерий, чем в положительных мазках при обработке мокроты без иммуносорбента.

Другая часть испытаний проводилась в условиях диспансерного и стационарного отде­лений противотуберкулезных диспансеров №4 и №15. Всего было обследовано 170 паци­ентов, из которых в ходе комплексного обследования у 106 пациентов установлен актив­ный туберкулез органов дыхания. Обработка образцов мокроты для выявления микобак­терий с помощью люминесцентной микроскопии проводилась 2-мя способами: а) с ис­пользованием традиционной обработки 10% раствором трехзамещенного фосфата натрия с последующей экспозицией в течение 12 часов и центрифугированием при 1-1,5 тыс. обор/мин; б) пробоподготовка с использованием реагентов набора «Микосорб», вклю­чающей разжижение раствором гидроксида и цитрата натрия, с добавлением ацетилци­стеина, последующую инкубацию с иммуносорбентом (иммуномагнитные частицы) и центрифугирование в аналогичных условиях (1-1,5 тыс. обор/мин) либо осаждение с по­мощью магнитного штатива. Результаты этих испытаний представлены на таблице 2.

 

Таблица 2. Сравнительная эффективность методов пробоподготовки образцов мокроты для выявления микобактерий методом люминесцентной микроскопии.

 

 

Полученные данные демонстрируют, что эффективность выявления микобактерий ме­тодом люминесцентной микроскопии у впервые диагностированных больных туберкуле­зом при использовании эффективной технологии с применением иммуномагнитного сор­бента достоверно выше по сравнению с традиционной пробоподготовкой и составила 32 %.

В отдельной серии экспериментов при исследовании 45 образцов мокроты, полученных от больных туберкулезом, проводили изучение эффективности обнаружения микобакте­рий в мазках при использовании реагентов «Микосорб» с целью сравнения  центрифуги­рования и магнитного осаждения на магнитном штативе. В обоих случаях мазки готовили из осадков, содержащих магнитные частицы. Из 45 исследованных образцов при исполь­зовании каждого метода было выявлено по 14 положительных результатов.

Это свидетельствовало о том, что применение иммуномагнитной технологии может по­зволить ликвидировать стадию центрифугирования при обработке образцов мокроты, что, очевидно, повышает безопасность работы персонала.

При сравнительном исследовании образцов мокроты 33 пациентов с инфильтративным туберкулезом легких, получавших специфическую химиотерапию в течение 2-х и более месяцев, традиционный метод обработки образцов для люминесцентной микроскопии вы­явил микобактерии в 6 случаях, что могло бы свидетельствовать об эффективности прове­денного лечения, тогда как пробоподготовка с использованием набора «Микосорб» позво­лила выявить микобактерии у этих же пациентов в 16 случаях.

Таким образом, повышение результативности метода люминесцентной микроскопии в качестве быстрого диагностического исследования благодаря использованию новой со­временной технологии является также существенно важным при контроле за эффективно­стью специфического лечения туберкулеза.