Микросферы широкого биомедицинского назначения: способы получения и области применения

МИКРОСФЕРЫ  ШИРОКОГО  БИОМЕДИЦИНСКОГО  НАЗНАЧЕНИЯ:

СПОСОБЫ  ПОЛУЧЕНИЯ И  ОБЛАСТИ  ПРИМЕНЕНИЯ

 

Филиппов В. И. 1,  Ершов О. Л. 2,  Жигалин Г. Я. 2 ,

Иванов П. К. 3,  Блохин Д. Ю. 3,  Голенкина Е. А. 3

 

                1. Институт биохимической физики имени Н. М. Эмануэля РАН,

                    Москва, 119991, ул. Косыгина, дом 4. E – mail: Chembio@sky.chph.ras.ru

                2. Государственный научно-исследовательский институт химии и технологии

                    элементоорганических соединений (ГНЦ РФ ГНИИХТЭОС),

                    Москва, 111123, шоссе Энтузиастов, д. 38.

                3. Российский онкологический научный центр имени Н. Н. Блохина РАМН,

                    Москва, 115478, Каширское шоссе, д. 24.

 

Термин «микросферы» используется для описания сферических частиц с размером в диа­пазоне 50 нм-2 мм. Частицы с размером менее 1 мкм могут быть отнесены к «наносферам», что указывает на их малый размер. Также используются термины «микрочастицы» и «нано­частицы», но без акцентирования на сферическую форму частиц. Термин «частица» вклю­чает в себя структуры, имеющие различия в морфологии, жесткости, как противопоставле­ние «мембраноидам», т.к. искусственные клетки и липосомы [1,2].

Полимерные микросферы, используемые для биологических и медицинских целей полу­чают из натуральных и синтетических источников.

 

Морфологические типы микросфер используемых

для биомедицинского применения

 

 

                                  А                                            Б                                          В

 

                                       А) - гомогенные или непористые микросферы;

                                        Б) - гетерогенные или пористые микросферы;

                                        В) - инкапсулированные микросферы

 

Микросферы, получаемые из натуральных источников т.к. альбумин, желатин, декстран, хитозан – являются биосовместимыми и биодеградируемымии. Микросферы, получаемые из синтетических мономеров – т.к. стирол, 4-винилпиридин, 2-гидроксиэтил метакрилат, мети­ленбис – акриламид и так далее – не являются биодеградируемыми. Микросферы могут быть «ме­чены» различными маркерами (метками или чувствительными устройствами), транспорти­роваться через физиологические среды и взаимодействовать с микроорганизмами как in vivo, так и in vitro. Метки или чувствительные устройства микросфер могут быть химическими, флуоресцентными, радиоактивными или магнитными [3,4,5]. Существуют методы получения микросфер, способных растворяться или деградировать после завершения их функций, а также ре активироваться для повторного использования.

Свойства микросфер и наличие технологических устройств позволяет использовать их в области биосепарации, клеточной и молекулярной биологии, иммунологии, энзимологии и диагностике. Микросферы также используются для направленной доставке лекарств и экст­ракорпоральной терапии [6,7].

Впервые использовал корпускулярное вещество (частицы угля) в биологических исследованиях в 1926 году Mast, который применил их для изучения движения клеточной поверхности у амебы [8]. В дальнейшем в 1940 г. Prinzmetal et al. исследовали коллатераль­ную  циркуляцию сердца человека с использованием радиоактивно меченых эритроцитов и стеклянных шариков [9]. За последние 30 лет область применения область применения кор­пускулярных полимерных материалов значительно расширилась. В частности, пионерская работа Rhode, Sheffel, Wagner, Zole et al. явилась началом развития хорошо известных в на­стоящее время альбуминовых микросфер для диагностических приложений [10].

В течение 70-80-х годов были разработаны методы аффинной, хроматографии, твердофаз­ного синтеза. Наступил новый этап в биомедицинской технологии, основанный на примене­нии микросфер. За последние годы значительно расширилась область исследований в на­правлении разработке и создании коммерческих препаратов микросфер для диагностики, в понимании поведения полимерных микросфер in vivo, разработке микросфер направленного действия для реализации направленной доставке лекарств.

 

Микросферы с реакционно-способными группами

 

Общий принцип получения микросфер, формируемых из водорастворимых (гидрофиль­ных) и жирорастворимых (гидрофобных) веществ состоит в получении эмульсий типа вода/масло или масло/вода, а также дисперсий. Полимерные микросферы, создаваемые из полисахаридов или белков, содержат функциональные группы – COOH, NH2 или OH. Это по­зволят прикреплять к ним молекулы-векторы т.к. иммуноглобулины или непосредственно после активирования или с помощью спейсера.

Такие микросферы получают в масляной или органической среде, внося в нее водный рас­твор белка или полисахарида. В такой системе двух несмешивающихся жидкость получают эмульсию вода/масло необходимой дисперсности и отверждают капли эмульсии с помощью поперечно-сшивающих реагентов или тепловой денатурацией. Полученные микросферы от­носительно гидрофильны, способны к био- и гидролитической деградации, а так же к набу­ханию в водной среде.       

Синтетические микросферы, особенно основанные на полистироле, являются гидрофоб­ными, механически жесткими (не способными к набуханию в водной фазе) и не биодегради­руемыми. Полистироловые микросферы (ПМ) обладают значительной связывающей способ­ностью в отношении таких субстратов, как белки, иммуноглобулины, красители или аффин­ные лиганды. Эта способность основана на не специфических гидрофобно-ароматических взаимодействиях. В последние годы усилия многих исследователей были направлены на по­лучение ПМ, имеющих в своем составе функциональные группы, способные связывать белки, иммуноглобулины или другие молекулы векторы путем формирования ковалентной связи.

Реакционно-способные или функционализованные ПМ получают двумя способами – со­полимеризацией подходящих сополимеров или функционализацией предварительно полу­ченных микросфер. Например, карбоксильная группа может быть введена в состав полисти­роловых микросфер с помощью малеинового альдегида в процесс эмульсионной полимери­зации [11].

 

Флуоресцентные микросферы

 

Встраивание флуоресцентной или оптической краски в микросферы  аналогично с введе­нием в их состав функциональных групп. Например, Juhlin  сообщил о не ковалентном встраивании в состав полистироловых микросфер зеленого флуоресцеина в процессе эмуль­сионной полимеризации [12].

Описано включение в состав микросфер таких красителей как родамин Б, родамин 6 Ж, метиленовый голубой, акридиновый оранжевый, бенгальский розовый, акрифлавин.

В настоящее время ряд фирм, например, BANCS lab., MACS предлагают пользователям окрашенные микросферы с различными красителями.

 

Магнитоуправляемые микросферы

 

В настоящее время сформулирован ряд требований, предъявляемым к магнитным аффин­ным микросферам для клеточной сепарации:

1.      Магнитные аффинные микросферы должны иметь небольшой магнитный момент, чтобы избежать их спонтанного агрегирования до взаимодействия с клетками. В тоже время их магнитные свойства должны быть достаточными, чтобы обеспечить магнито­форез в неоднородных магнитных полях доступной напряженности – 1000-3000 Эр­стед;

2.      Магнитные аффинные микросферы (МАМ) должны обладать суперпарамагнетизмом, который позволит им иметь минимальную остаточную намагниченность и отсутствие агрегирования после воздействия неоднородного магнитного поля.

3.      Неспецифическую адгезию МАМ к клеткам следует свести к минимуму.

4.      Процесс производства МАМ не должен быть крайне сложным.

В настоящее время установлено, что для оптимального взаимодействия магнитных аф­финных микросфер с клетками должен составлять 2 мкм, а размеры ферромагнитной фазы не превышать 50 нм. [13].

Как уже было указано выше, в состав микросфер необходимо инкорпорировать одно- или субдоменные частицы ферромагнетика.

В предположении, что магнитный момент микросферы не зависит от внешнего магнит­ного поля, магнитную силу, действующую на единичную микросферу можно представить в виде:

 

F = N* V * H * dH/ dX, где

 

N – коэффициент равный 3; V – объем микросферы

H – напряженность магнитного поля; dH / dX – градиент магнитного поля.

 

Различные способы, предлагаемые для производства магнитных аффинных микросфер можно разделить на две категории, именуемые инкорпорирование и импрегнацию.

Метод получения гидрофильных магнитных микросфер в суспензионной полимеризации и применения поперечно сшивающих реагентов. Для их приготовления ферроколлоид про­сто смешивают с водным раствором полимера или смесью мономеров, формированием мик­росфер и их получением.

В случае гидрофобных микросфер, таких как полистироловых или полицианкрилатных, инкор­порирование (встраивание) частиц ферромагнетика в процессе формирования микросфер требует особых условий.

Для приготовления полистироловых микросфер из водного ферроколлоида с помощью суспензионной полимеризации, ферроколлоид должен быть вначале диспергирован в рас­творе мономера с образованием суспензии вода в масле. Эту суспензионную смесь дробно вносят в больший объем воды при перемешивании и проводят суспензионную полимериза­цию.

При использовании феррожидкости, то есть феррочастиц, находящихся в органической фазе (например, в толуоле) производят смешивание раствора  мономеров с феррожидкостью, вно­сят эту смесь водную фазу с получение эмульсии масло/вода и осуществляют эмульсионную полимеризацию при температуре 40-90°С.

Метод импрегнирования состоит в инкорпорировании частиц оксида железа в уже сфор­мированные микросферы. Этот метод также подходит для гидрофильных микросфер.

Относительно простой метод был предложен Mosbach and Anderson, предложившими пропускать водный ферроколлоид через колонку, заполненную агарозой [14]. В другом вари­анте магнитные частицы инкорпорировали в гидрофильные оболочки, состоящие из молекул глицилметакрилата, метакриловой кислоты и этилендиметакрилата.

 

 

 

 

Ферромагнитные микрочастицы

 

Для решения ряда медицинских задач наличие сферической формы твердофазного ферро­магнитного носителя (ТФН) не является обязательным. Например, ферромагнитные микро­частицы могут быть использованы для осуществления магнитоуправляемого транспорта ле­карственных препаратов, проведения экстракорпоральной магнитной гемосорбции, для со­вершенствования методов диагностики бактерий и вирусов.

Плазмохимический метод получения ультрадисперсных порошков позволяет получать композитные ферромагнитные микрочастицы, содержащие углерод или оксид кремния. (Па­тент РФ №2140084 Матрица иммуносорбента. Приоритет от 12.01.98).

Предложенный способ получения ферромагнитных микрочастиц (ФМ) позволяет полу­чать композитные структуры близкие к сферической форме, ядро которых состоит из железа.

Такие ФМ могут быть активированы с помощью металлохелатного с использованием со­лей хлорида титана, что позволяет прочно фиксировать до 80 мг иммуноглобулинов на мг носителя.

Иммуномагнитный препарат, полученный с использованием антител к микобактериям ту­беркулеза (штамм Н37Rv), полученный из сыворотки иммунизированных кроликов, был ап­робирован в экспериментах по селективному магнитному концентрированию микобактерий туберкулеза из клеточных суспензий и в клинических условиях.

Данный тип активированного магнитного микроносителя может быть использован для получения иммуносорбента с использованием антител к антигенам широкого спектра.

 

Список литературы:

 

1.      Chang, T. M. S. Semipermeable microcapcules // Science 1964, 146, 524-525

2.      Gregoriadis G. Liposome Technology, V.1 – 3,CRC Press, Boca Raton, FL, USA, 1984.

3.      Rembaum A., Toke Z. A. Microspheres: Medical and Biological Applications CRC Press, Boca Raton, FL, USA, 1988

4.      Fornusek, L., Vetvika V., Polymeric microspheres as diagnostic tool for cell surface mar­cer tracing, CRC Crit. Rev.Therap. Drug Carrier Syst.1986, V.2, P.137 – 174.

5.      Strand S. E., Anderson L., Bergquist L. Application and characterization of radiolabelered and magnetizable nano- and for RES, lymph and blood flow studes, in Microspheres, Medical and Biological Applications (Eds, A. Rembaum and Z.A. Toke), CRC Press, Boca Raton, FL, USA, 1988, P.165 – 192.

6.      Arshady R. Biodegradable microcapsular drug delivery system // J. Bioactive Compatible Polym., 1990, V.5, P.316 – 342.

7.      Parker B. M. Anderson D.C., Smith J. R. Observatios on arterio- venous communications in lung of dogs, Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1958, V.98, P.306 – 308.

8.      Mast S. O. Structura, movement, locomotion and simulation in amioeba // J. Morfol. Physiol.1926, V. 41, P.347 – 472.

9.      Hrinzmetal M., Simptkin B., Beyerman H. C., Kruger H. E. Studies on coronary circulation // Am. Heart  J., 1947, V. 33, P. 420 – 422.

10.  Scheffel U., Rhodes B. A., Natarjan T. K., Wagner H. N. Albumin misrospheres for the study of reticuloendotelial system // J. Nucl. Med., 1972, V.13, P. 498 – 503.

11.  Arshady R. Preparation of polymer nano- and microspheres by vinyl polymerisation technques // J. Vitro encapsulation, 1988, V.5, P.101 – 114.

12.  Madison R., Maklins J. D. Latex nanospheres delivery systems // Brain. RES, 1990, V. 7,  № 3, P.187 – 192.

13.  Kronic P. L. // Magnetic Microsheres in Cell Separation. Vol 3. P.115-139

14.  Mosbach K. Anderson B. Magnetic ferrofluid for the preparation of magnetic polymer and their application for affinity chromatography // Nature, 1977, V. 270, P.259 – 260.