МАГНИТОУПРАВЛЯЕМЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ТЕРАПИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Брусенцов Н. А., Комиссарова Л. Х., Байбуртский Ф. С.
Институт биохимической физики имени Н. М. Эмануэля РАН,
Москва, 119991, ул. Косыгина, д. 4, телефон:936 – 17 – 45, E – mail: Bayburt@mail.ru
За последние десятилетия стал быстро развиваться метод иммуномагнитной сепарации субклеточных структур и клеток, основанный на использовании моноклональных антител, фиксированных на поверхности магнитоуправляемых микросфер. Для определения способов получения магнитоуправляемых материалов, используемых в диагностике, при трансплантации костного мозга и стволовых кроветворных клеток, авторами был проведен обзор научных публикаций [1 – 4].
Поверхность микросфер, которая была сформирована из полистирола, полиглутарового альдегида, полиакролеина, обеспечивала возможность адсорбции и химического связывания моноклональных антител. Образующиеся при этом конъюгаты специфично связывались с объектами-мишенями, и направленно перемещались в магнитном поле, увлекая мишени за собой в соответствие с увеличением градиента постоянного магнитного поля. Этим способом из биологических жидкостей были выделены протеины, нуклеиновые кислоты, хромосомы, клетки и микроорганизмы. Методы получения магнитных микросфер и иммуномагнитных сорбентов были разработаны фирмой Dynal (Oslo, Norway). Магнитные сорбенты Dynabeads M-270, покрытые специфическими антителами к опухолевым клеткам крови и костного мозга, были успешно использованы при диагностике и лечении онкологических заболеваний. Чувствительность метода составляла 1 опухолевую клетку на 1 мл крови. Магнитные микросферы, полученные на основе поливинилового спирта, были применены при разделении нуклеиновых кислот [1].
При сепарации клеток были использованы высокоградиентные магнитные поля. Были рассмотрены различные типы магнитных материалов для изготовления постоянных магнитов, используемых в устройствах при магнитной сепарации клеток. Были приведены методы их испытаний и физические характеристики. Примером успешного использования магнитных систем при выделении стволовых клеток может служить квадрупольный магнитный высокопроизводительный (10 7 клеток/сек) проточный сепаратор. Прилипание иммуномагнитных частиц, специфичных к антигенным и цитокиновым рецепторам на опухолевых клетках определяли магнитофорезом. Не менее 200 молекул рецептора, фактора некроза опухолей на опухолевую клетку, определяли с помощью частиц, покрытых стрептавидином, которые конъюгировали с предварительно биотинилированными факторами некроза опухолей в качестве лигандов.
В зависимости от уровня токсичности магнитные микросферы и магнитные сорбенты применяли следующим образом:
1. оставляли на клетках декстранферрит и конъюгаты декстранферрита с лигандами, магнетито-декстран и конъюгаты магнетито-декстрана с антителами; магнитные микросферы они обладали низкой токсичностью и полностью метаболизировались в организме млекопитающих.
2. отщепляли от клеток ферментами или релизинг пептидом; магнитные микросферы (полистироловые магнитные сорбенты) не метаболизировались в организме, они обладают высокой токсичностью.
Все магнитные сорбенты, полученные на основе синтетических полимерных магнитных микросфер (диаметр от 0,1 до 6 мкм) с инкапсулированными в них ферро- или ферримагнетиками, были токсичны, поскольку они не метаболизировались в организме больного и вызывали тромбоз. Поэтому после выделения комплекса «клетка – магнитный сорбент» необходимо было отщеплять магнитные сорбенты от клетки действием ферментов, но при этой манипуляции могли изменяться поверхности клеточных мембран. Значительно избирательнее и мягче действуют релизинг пептиды, но при вытеснении клеток из комплексов «клетка – магнитный сорбент» релизинг пептидами, для каждого нового комплекса было необходимым использовать специфичный релизинг пептид.
Созданию нетоксичных магнитоуправляемых микросфер, нетоксичных иммуномагнитных сорбентов, разработке и применению методов иммуномагнитной сепарации антигенов, используемых при трансплантации стволовых кроветворных клеток, были посвящены перечисленные научные публикации [2, 3].
Не было необходимости отщеплять нетоксичный иммуномагнитный сорбент в комплексе «нетоксичный магнитный сорбент – клетка», поскольку он, как правило, не нарушал её функциональных свойств. Это открытие позволило заменить токсичные магнитные сорбенты, которые необходимо отщеплять от клеток, на нетоксичные магнитные сорбенты, не требующие этого отщепления.
Учитывая важность нетоксичных магнитных сорбентов в сепарации клеток костного мозга, мы привели один из способов их синтеза и методы получения исходных веществ, необходимых для этого. Нетоксичные магнитные сорбенты получали на основе магнетита, декстрана и специфичных антител:
1. Поверхность кристаллов магнетита, активированную ионами Cl -, покрывают декстраном, получают магнитные микросферы декстранферрита;
2. Магнитные микросферы декстранферрита обрабатывают по общей схеме: поверхность магнитных микросфер декстранферрита окисляли действием периодата калия (КIO4) или периодата натрия (NaIO4); таким образом получали магнитные микросферы полиальдегиддекстранферрита; их инкубировали с моноклональными антителами и получали конъюгаты, представляющие собой нетоксичные иммуномагнитные сорбенты.
Химическая схема синтеза нетоксичных магнитных сорбентов
на основе декстранферрита и моноклональных антител:
+ KIO4
(g-Fe2O3) r-m (Fe2O3FeO) m (C6H9O5) f (C6H10O5) q-f -----®
+ H2N-R
(g-Fe2O3) r-m (Fe2O3FeO) m (C6H9O5) f (C6H10O5) q-f-j (C4H4O4) j -----®
(g-Fe2O3) r-m (Fe2O3FeO) m (C6H9O5) f (C6H10O5) q-f-j (C4H6O4N-R) j
r – число молекул оксида железа в кристаллическом ядре феррита;
m – число остатков молекул оксида железа, связанных с ионами хлора
или остатками глюкозы;
q – число остатков глюкозы в молекулах декстрана;
f – число остатков глюкозы, связанных c оксидом железа;
j – число остатков глюкозы, связанных c иммуноглобулином;
R – иммуноглобулин.
Окисление декстранферрита периодатом натрия проводили при +20oС 30 минут. Иммуномагнитный сорбент, который был получен на основе магнитных микросфер полиальдегиддекстранферрита и моноклональных антител, являлся конъюгатом, который имеет диаметр кристаллического ядра 10 нм, диаметр мицеллы до 300 нм, число частиц до 1,5 . 109 / г, удельную намагниченность насыщения 3 – 12 А×м2/кг; в применяемых дозах он был нетоксичен, поскольку полностью метаболизировался в организме млекопитающих. После выделения в неоднородном постоянном магнитном поле комплекса «полиальдегиддекстранферрита – моноклональные антитела – клетка» не было необходимости отщеплять от клетки конъюгат «полиальдегиддекстранферрит – моноклональные тела», поскольку он был нетоксичен в применяемых дозах. Электрокинетический потенциал декстранферрита составил +15 мВ при рН 6,6; ЛД50 декстранферрита 5 г/кг при внутривенном введении мышам. При внутривенном и внутрибрюшинном введении мышам в естественных условиях декстранферрит накапливался в печени и в селезенке. При внутриартериальном регионаром введении собакам в неоднородном постоянном магнитном поле декстранферрит концентрировался в местах с максимальным градиентом постоянного магнитного поля и индукционно нагревался от +43 до 46oС в переменном магнитном поле на частотах от 50 до 1000 кГц.
Для получения иммуномагнитных сорбентов были необходимы магнитные микросферы и моноклональные антитела. Разработанная в 70-х годах гибридомная технология и сегодня была использована в качестве основного способа получения моноклональных антител. Процесс получения чистых линий «антитело – продуцирующих клеток» помимо генно-инженерных манипуляций включал: сепарацию клеток, скрининг и клонирование образовавшихся гибридом. Перечисленные процедуры были трудоемки. Один из возможных вариантов модернизации, позволяющий значительно сократить время и повысить количество получаемых гибридомных клеток, состоял в использовании иммуномагнитной сепарации желаемых клонов. Супернатанты всех образующихся колоний тестировали методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) для выявления продуцентов анти-hCG-антител. Химически связывая полученный hCG-антиген с магнитными микросферами Dynabeads M450 (Dynal, Norway) получали иммуномагнитный сорбент – анти-hCG-M450 и с помощью иммуномагнитной сепарации выделяли позитивные колонии. Антигено-специфические гибридомы отделяли от несекретирующих клеток с помощью SmCo магнита. Клетки положительной фракции, связанные с частицами сорбента, повторно растворяли в среде и рассевали по 96-луночным планшетам. Стадия получения культур клеток-продуцентов следовала непосредственно за иммуномагнитной сепарацией, минуя стадию отщепления сорбента, которая обычно представляла затруднение при положительной иммуномагнитной сепарации. Гибридомы, изолированные этим способом, секретировали высоко аффинные (много больше 1 . 10 9 моль – 1 ) моноклональные антитела одного изотипа [4].
В настоящее время биомагнитные сорбенты успешно применяются для иммуномагнитной сепарции клеток. В ГУ РОН им. Н. Н. Блохина РАМН и ИБХФ им. Н. М. Эмануэля РАН проводятся работы по созданию магнитных микроносителей на основе кремнесодержащих полистироловых и декстранферритовых матриц. Разработаны методы синтеза микросфер различной дисперсности, испытаны разные способы активации поверхности частиц, позволяющие конъюгировать их с моноклональными телами. Применение клеточной сортировки для восстановительной трансплантологии после курсов массированной химио- и лучевой терапии позволяет значительно снизить гематотоксические осложнения консервативного лечения онкологических больных и сократить сроки их реабилитации. Сочетание позитивной и негативной сортировки позволяет получать гомогенные препараты минорных субпопуляций клеток для биотерапии (дендритные клетки для создания вакцин). Актуальной задачей позитивной сортировки остаётся проблема обеспечения контролируемой деструкции комплекса «микрочастица – клетка», поскольку после извлечения клетка, предназначенная для аутотрансплантации, должна оставаться функционально репродуктивно-активной и не содержать на поверхности биологически активных или инертных частиц. Выходом в данной ситуации может быть использование в качестве матрицы иммуносорбента биодеструктируемых декстранферритовых наночастиц. Возможно и применение в качестве лигандов (связывателей) между активным лигандом и матрицей молекул, которые не повреждают жизненную способность клетки.
Работа проводилась при финансировании грантов РФФИ № 02 – 01 – 00694 и Московского правительства № 113 / 03 – ГП – М.
Список литературы:
1. Брусенцов Н. А., Бурова О. С., Барышников А. Ю., Брусенцова Т. Н., Мошечков Н. Г., Махлин Р. С.: Применение биомагнитных носителей в медицине. Сборник докладов. 2002, Москва, ИБХФ им. Н. М. Эмануэля РАН, С. 60 – 67.
2. Филиппов В. И., Иванов П. К., Блохин Д. Ю., Курбатова Е. С., Ершов О. Л., Жигалин Г. Я., Богословская Е. В., Шипулин Г. А.: X Международная Плёсская конференция по магнитным жидкостям. Сборник научных трудов. 2002, Иваново – Плёс, С. 305 – 307.
3. Хрусталёва И. П., Московцев А. А., Иванов П. К., Блохин Д. Ю., Ешов О. Л., Филиппов В. И., Жигалин Г. Я., Мошечков Н. Г., Махлин Р. С.: X Международная Плёсская конференция по магнитным жидкостям. Сборник научных трудов. 2002, Иваново – Плёс, С. 313 – 317.
4. Голенкина Е. А., Московцев А. А., Иванов П. К., Блохин Д. Ю., Ершов О. Л., Филиппов В. И., Барышников А. Ю., Мошечков Н. Г., Махлин Р. С.: X Международная Плёсская конференция по магнитным жидкостям. Сборник научных трудов. 2002, Иваново – Плёс, С. 343 – 346.