ДЕТОКСИКАЦИЯ ОРГАНИЗМА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МАГНИТОУПРАВЛЯЕМЫХ СОРБЕНТОВ

Комиссарова Л. Х. ¹, Филиппов В. И. ¹, Гончаров Л. А. ¹, Попова Т. С. ²,

Кутушов М. В. ², Мартынов А. Н. ³, Брусенцов Н. А. ¹, Байбуртский Ф. С. ¹

1. Институт биохимической физики имени Н. М. Эмануэля РАН,

г. Москва, ул. Косыгина, д. 4, Chembio@.sky.chph.ras.ru, Bayburt@mail.ru

2. Научно-исследовательский институт скорой помощи имени М.В. Склифосовского,

г. Москва, Большая Сухаревская площадь, д. 3.

3. Научно-исследовательский институт физико-химической медицины РАМН.

г. Москва, ул. Малая Пироговская, д. 117.

Для детоксикации организма от эндо- и экзотоксинов наибольшее распространение в клинической практике имеют такие методы, как гемодиализ, ультрафильтрация и гемосорбция. Гемодиализ и ультрафильтрация в основном используются для удаления низкомолекулярных соединений. Соединения со средним молекулярным весом и тем более с высоким не проходят через мембрану диализатора. Методы требуют большого объема одномоментно выводимой из организма крови, вызывают травматизацию форменных элементов крови и, кроме того, являются дорогостоящими. Метод гемосорбции с использованием стандартных колонок, заполненных гемосорбентами, позволяет расширить диапазон выводимых из крови токсинов [1], однако, имеет ряд негативных сторон: большой объем выводимой из организма крови, низкую эффективность сорбции токсинов, травматизацию крови и изменение ее биохимических показателей. Отрицательное воздействие на кровь обусловлено как длительным контактом крови (более 1 час) с активированным углем, наиболее широко используемым в качестве гемосорбента, так и с высоким гидравлическим сопротивлением из-за необходимости применения определенного типа насосов для прокачки большого объема крови через колонку. Уменьшение размера частиц адсорбента для повышения эффективности сорбции приводит к увеличению гидравлического сопротивления и возрастанию повреждающего воздействия на кровь.

Нами предложен и испытан новый метод и устройство для детоксикации биологических сред организма с использованием в качестве адсорбентов ферромагнитных частиц микронного и субмикронного размеров различного состава [2]. Обычно использовалось композитные частицы, магнитной фазой которых являлось железо или его окислы, сорбирующей фазой – углерод, окислы кремния или алюминия, испытывалось также восстановленное железо. Эти частицы благодаря малым размерам имеют высокую сорбционную емкость и скорость удаления целевых компонентов из биологических жидкостей.

1. Общая схема магнитной гемосорбции:

Кровь, выведенная из артерии, смешивается с суспензией ферромагнитных частиц (рисунок 1), новые порции которой постоянно поступают в камеру смешивания. После завершения процесса сорбции частицы адсорбента, содержащие токсины, отделяются в магнитном сепараторе, а очищенная кровь возвращается в организм. Использование насоса не является обязательным, кровь может двигаться за счет артериовенозного перепада давления, что значительно снижает травматизацию клеток крови; объем крови, требуемый для заполнения устройства и систем коммутации (40-80 мл), значительно меньше, чем в стандартном методе гемосорбции (150-350 мл). Процесс адсорбции происходит в ламинарном потоке смеси крови и магнитных частиц. Время взаимодействия частиц с кровью определяется длиной и сечением трубки коммутации от камеры смешивания суспензии с кровью до магнитного сепаратора и скоростью потока крови и составляет порядка 2 – 10 секунд.

Рисунок 1. Обшая схема магнитной гемосорбции

2. Материалы и методы:

Большая часть исследований была выполнена с использованием железо-углеродных частиц, полученных термокаталитическим способом (реакция между оксидом углерода и окислами железа) или плазмохимическим методом [3]. Для опытов в стационарных условиях использовались также частицы восстановленного железа с содержанием окислов менее 10% и композиты состава железо-углерод и железо-окислы кремния, полученные термическим методом [4]. Магнитная восприимчивость магнитоуправляемых сорбентов (МУСов) определялась с помощью магнетометра Фарадея [3].

Был проведен скрининг сорбционной эффективности МУСов (около 100 образцов) к низко-, средне- и высокомолекулярным соединениям. В качестве низкомолекулярных соединений были взяты барбитураты (натрия тиопентал, натрия гексенал, натрия фенобарбитал), средних молекул – цианкобаламин (витамин В₁₂ и билирубин, макромолекул – человечий гемоглобин.

Известно [1], что углерод, железо или его окислы при контакте с кровью вызывают повреждение эритроцитов и тромбоцитов, нарушение баланса компонентов плазмы, в том числе, альбумина и глобулинов, обусловленного их сорбцией. В связи с этим проводилась химическая модификация поверхности МУСов белками или полисахаридами. В опытах in vivo (на собаках) модификацию осуществляли ex temporary путем смешивания порошка феррочастиц в растворе желатиноля с помощью ультразвука для диспергирования конгломератов. В серии опытов в стационарных условиях поверхность МУСов покрывали альбумином, желатином или декстраном по методу Wieder [1979] в нашей модификации [4]. Белки или полисахариды, сорбированные на ферромагнетиках, фиксировались в их структуре реакцией с глутаровым альдегидом. МУСы с модифицированной поверхностью не теряли сорбционной активности при хранении их водных растворов при температуре 4-6^оС. МУСы на основе окислов кремния не оказывают повреждающего воздействия на кровь и не требуют модификации.

Сорбционная эффективность МУСов определялась как отношение адсорбированного вещества к первоначальному его количеству (по весу) и выражалась в процентах. Исследования в статических условиях проводились при концентрациях веществ 100-200 мкг/мл и весовых отношениях адсорбент вещество равными: 1; 2,5; 5; 10; 25; 50. Вещества в 10 мл физиологического раствора, или донорской плазмы, или донорской крови перемешивались с МУСом при комнатной температуре 1 мин. После осаждения частиц МУСа с помощью самарий-кобальтового магнита напряженностью порядка 0,5 Тл определяли концентрацию веществ в надосадочной жидкости с помощью дифференциальной спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях. В плазме и донорской крови концентрацию соединений определяли с помощью тонкослойной хромотографии с применением флуоресцентного индикатора и дифференциальной спектрофотометрии безбелковых фильтратов.

Исследования в динамических условиях проводили на экспериментальной установке, состоящей из магнитного сепаратора, емкости, содержащей суспензию МУС, устройства смешивания суспензии МУС с физиологическим раствором или свежецитратной кровью с заданной концентрацией токсинов, системы коммутаций, емкостей для подачи и сбора биологических жидкостей.

Магнитный сепаратор представляет собой прямоугольную камеру, выполненную из тефлона, объемом 10 см³, внутри которой расположена ферромагнитная проволока диаметром 0,5-1 мм. Снаружи камеры с двух сторон фиксируются по два постоянных магнита, выполненных из сплава неодим-железо-бор с размерами 40х40х10 мм. и снабжаются магнитопроводом. Магнитная индукция в сепараторе достигала 1 Тл. В устройство для смешивания объемом 5 см³, выполненного из полистирола, одновременно поступает суспензия МУСа с помощью перистальтического насоса и очищаемая биологическая жидкость с помощью роликового насоса; в экспериментах на животных ток крови осуществлялся за счет артериовенозного перепада давления Смеситель соединялся с магнитным сепаратором коммутационными трубками из пластика. В модельных экспериментах поток очищаемой жидкости объемом 1000 мл подавался со скоростью 100 мл/мин при температуре 25°С. Растворы барбитуратов, цианкобаламина и гемоглобина с концентрацией 100 мкг/ мл пропускались через устройство 1, 2 или 3 раза при непрерывном перемешивании с суспензией МУСа с концентрацией, поддерживаемой на уровне 0,5 мкг/мл. Для оценки качества работоспособности магнитного сепаратора проводились измерения намагниченности образцов выходящей из сепаратора биологической жидкости.

Для сравнения были проведены опыты по сорбции барбитуратов на образцах активированного угля марки СКТ-6А в статических и динамических условиях.

Исследования эффективности предложенного устройства in vivo проводили на собаках весом от 12 до 19 кг. Затравку осуществляли путем внутривенного введения фенобарбитала натрия в дозе 400-600 мг/кг массы тела; при этом концентрация барбитуратов в крови достигала 100-200 мкг/мл. Животным накладывали артериовенозный шунт на бедре, к которому подключали магнитное сепарирующее устройство. Брали пробы крови до начала опыта и в процессе гемосорбции в течение 60 мин для определения биохимических, реологических и иммунологических показателей, также определяли концентрацию барбитуратов.

3. Результаты и обсуждение:

В опытах в статических условиях обнаружено, что эффективность адсорбции барбитуратов для МУСов типа железо-углерод возрастает с увеличением доли углерода от 20 до 80 % (рисунок 2), но при этом снижаются значения магнитной восприимчивости образцов, что усложняет магнитную сепарацию частиц. Оптимальными по сорбционным и магнитным характеристикам являются образцы МУСов с содержанием углерода 40-50 % и магнитной восприимчивостью не менее 50 еmu/g. Эффективность адсорбции соединений различной молекулярной массы зависит от типа адсорбента, состава и структуры молекул адсорбата и адсорбента, отношения массы адсорбента к массе адсорбата (рисунок 3). Кривые эффективности адсорбции гексенала натрия и тиопентала натрия были аналогичными. Оптимальное отношение адсорбента к адсорбату для МУСов типа железо-углерод в статических условиях для барбитуратов составляет: 15-20, для цианкобаламина и билирубина: 20-25, для гемоглобина: 40-50. Эффективность адсорбции для данного типа адсорбента и адсорбата зависит также от химической модификации его поверхности.

Рисунок 2. Эффективность адсорбции Рисунок 3. Эффективность адсорбции

барбитурата (гексенал натрия) от фенобарбитала натрия МУСом типа

содержания углерода в МУСе. железо-углерод от отношения масс

адсорбент / адсорбат.

Таблица 1.

Сорбционная эффективность МУСов к веществам

различной молекулярной массы в физиологическом растворе при рН 7,4

Тип МУСа	Сорбционная эффективность, % ( ± Δ % )
Восстановленное Железо	Фенобарбитал Молекулярная масса 232		Цианкобаламин Молекулярная масса 1355		Гемоглобин Молекулярная масса 64000
	Немодиф. МУС	Модиф. желатином	Немодиф. МУС	Модиф. желатином	Немодиф. МУС	Модиф. желатином
	38,6 ± 6,3	40,4 ± 7,4	9,0 ± 6,1	11,1 ± 3,4	32,3 ± 7,1	54,4 ± 8,2
Железо – углерод	49,9 ± 6,8	55,2 ± 7,0	21,4 ± 5,3	23,2 ± 6,1	37,6 ± 7,6	52,7 ± 7,8
Железо – кремний	85,7 ± 10,2		33,5 ± 7,7		22,5 ± 5,8

Как видно из таблиц 1 и 2, сорбционная эффективность железо и железо-углеродных МУСов с модифицированной и немодифицированной поверхностью к барбитуратам (на примере фенобарбитала натрия) и цианкобаламина в физиологическом растворе и донорской плазме была практически одинаковой. Это свидетельствует о том, что большая часть пор, характерная для данного типа адсорбента, остается доступной для молекул этих веществ. В то же время, сорбционная эффективность модифицированных МУСов по отношению к гемоглобину (табл. 1 и 2) и билирубину (табл. 3) возрастает. Механизм сорбции гемоглобина и билирубина [5] на модифицированных белками МУСах, очевидно, обусловлен электростатическим взаимодействием карбоксильных групп желатина и альбумина с аминогруппами гемоглобина или метильными группами билирубина.

Таблица 2.

Сорбционная эффективность МУСов к веществам

различной молекулярной массы в донорской плазме.

Среда Инкубации (рН 7,4)	Сорбционная эффективность, % ( ± Δ %)
	Без модифицирования	Модифицирование желатином	Модифицирование альбумином
Физиологический раствор	29,0 ± 5,7	66,7 ± 7,4	70,8 ± 8,6
Донорская плазма	0	34,4 ± 5,9	59,2 ± 8,1

Таблица 3.

Сорбционная эффективность МУСов (типа железо-углерод) к билирубину.

Вещества	Сорбционная эффективность, % ( ± Δ %)
	Железо – кремний	Железо – углерод, модиф. желатином	Железо – углерод, модиф. альбумином
Фенобарбитал	67,3 ± 8,4	46,8 ± 7,9	43,1 ± 7,2
Цианокобаламин	23,1 ± 4,3	13,5 ± 4,1	15,7 ± 5,8
Билирубин	£ 42	34,3 ± 5,9	59,2 ± 10,3
Гемоглобин	11,9 ± 3,8	39,4 ± 7,0	44,5 ± 6,6

Высокие значения сорбционной эффективности барбитуратов обнаружены для железо-силикатных МУСов (таблицы 1 – 2). Гемосовместимые железо-силикатные и железо-алюмосиликтные МУСы могут быть использованы также для селективного извлечения креатинина и других метаболитов. Эксперименты в динамических условиях с использованием магнитного сепарирующего устройства проводились с МУСами типа железо-углерод («Цефесорб»). При проведении 2-х или 3-х циклов гемосорбции концентрация метаболитов (барбитураты, цианкобаламин, гемоглобин) снижалась до уровня 5-15 %, что превосходит эффективность гемосорбции на активированном угле (при одинаковых массах адсорбента) в 2-2,5 раза. Анализ растворов и донорской крови, прошедших через сепаратор, показал отсутствие в них частиц МУСов, что свидетельствует о практически их полном удерживании в сепараторе.

Метод магнитной экстракорпоральной детоксикации был апробирован на собаках. Рисунок 4 демонстрирует эффективность удаления из крови собак фенобарбитала натрия с использованием МУСа «Цефесорб» и перфузии через колонку с активированным углем марки СКТ-6А. При использовании 10 г МУСа и такого же количества СКТ-6А концентрация фенобарбитала натрия в крови за 60 мин. гемосорбции снизилась до 25 % и 60 % соответственно. Результаты анализа некоторых биохимических показателей крови собак до и после магнитной гемосорбции представлены в таблице 4. Из таблицы видно, что отмечалось небольшое снижение концентрации белков. Изменений других биохимических показателей и гемолиза эритроцитов не обнаружено.

Рисунок 4. Эффективность удаления фенобарбитала натрия из крови собак

при использовании МУСа «Цефесорб» (1) и активированного угля марки СКТ-6А (2).

Таблица 4. Биохимические показатели крови собак до и после магнитной гемосорбции

Показатели	До гемосорбции	После гемосорбции
Общий белок, мг / мл	78,8	63,0
Альбумин, мг / мл	25,3	20,0
Глобулины, мг / мл	52,2	43,2
Мочевина, мкг / мл	4,6	4,4
Креатинин, мкг / мл	96,6	26,0
Билирубин, мкг / мл	3,6	3,7
Калий, мкг / мл	3,3	2,6
Гемолиз, %	0,100	0,062

4. Заключение:

Предложен и испытан новый метод и устройство для экстракорпоральной детоксикации организма с использованием магнитоуправляемых сорбентов (МУСов). Показано, что эффективность удаления барбитуратов из крови животных (собаки) при магнитной гемосорбции значительно превосходит таковую при использовании стандартной сорбционной колонки с активированным углем. Малые габариты устройства, небольшой объем одномоментно выводимой из организма крови позволяет применять метод магнитной гемосорбции не только в стационарных условиях, но и на догоспитальном этапе при эндо- и экзотоксикозах различной этиологии, в том числе, при химиотерапии для понижения токсических эффектов противоопухолевых препаратов. Возможность химической модификации поверхности МУСов позволяет синтезировать на их основе магнитные иммуносорбенты с целью удаления из биологических сред патогенной микрофлоры и вирусов.

Список литературы:

1. Лопухин Ю.М., Молоденков М.Н. Гемосорбция. М., Медгиз. 1985.

2. Комиссарова Л.Х., Филиппов В.И. и др. Патент РФ № 2008929, 1991.

3. Филиппов В.И., Кутушов М.В. // Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers

Plenum-Press, New-York, 1997, p. 380.

4. Комиссарова Л.Х., Кутушов М.В, Глухоедов Н.П. // Патент РФ № 2109522, 1996.

5. Комиссарова Л.Х., Кутушов М.В. // J. Magn. Magn. Mater. 225 (2001) 197.